聚乳酸-聚乙二醇共聚物/表面接枝复合纤维材料与成骨细胞的黏附、增殖及活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.39.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量的研究表明，应用于骨组织工程的材料，如羟基磷灰石及高分子聚乳酸等，均对骨缺损的修复起到了一定的作用。但单一的材料在组织相容性及仿生学等特点诸多方面，无法满足骨组织生长的需要，将现有的单一材料进行改性再复合产生新的材料是骨组织工程发展的一个重要方向。
目的：通过静电纺丝技术制备共混的聚乳酸-聚乙二醇共聚物/表面接枝羟基磷灰石复合纤维材料，探讨表面接枝羟基磷灰石的引入及其在材料中的含量对成骨细胞在新型材料黏附、增殖和细胞活性的影响。
方法：通过调整静电纺丝溶液中聚乳酸-聚乙二醇共聚物和表面接枝羟基磷灰石的4个质量百分数比例，5%/0%，5%/5%，5%/10%，5%/15%，分别制备的4种新型材料(样品1，2，3，4)与小鼠成骨细胞共培养，在特定的时间点，通过细胞染色、碱性磷酸酶检测等实验方法，获得4种不同材料对与之共培养的成骨细胞的相关数据。通过对上述数据进行统计分析，评价新型材料对成骨细胞黏附、增殖能力及细胞活性的影响。
结果与结论：在细胞黏附实验中，3组含有表面接枝羟基磷灰石成分的新型材料与不含的材料相比，细胞数量均增长明显，各组细胞增殖情况和碱性磷酸酶活性从高到低依次为样品3组>样品4组>样品2组>样品1组(P < 0.05)。结果证实，聚乳酸-聚乙二醇共聚物中引入表面接枝羟基磷灰石后其生物活性得到提高，且新型材料中表面接枝羟基磷灰石含量可影响材料与成骨细胞相容性及细胞活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 聚乳酸-聚乙二醇共聚物, 表面接枝羟基磷灰石, 碱性磷酸酶, 聚乳酸, 复合材料, 生物相容性, 黏附, 增殖, 细胞活性

Abstract:

BACKGROUND: Recent advances in polylactic acid-polyethylene glycol (PLA-PEG) block copolymer and hydroxyapatite surface-grafted with poly(l-lactide) (HA-g-PLLA), including their synthesis and preparation, have been approved for application in bone tissue engineering. But they have still many disadvantages. Combination of HA-g-PLLA and PEG–PLA could show a great potential for development in bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To investigate the effect of PLA-PEG/HA-g-PLLA composite fibrous material with different content of HA-g-PLLA on adhesion, multiplication and cell viability of osteoblasts.
METHODS: Four fibrous materials of 5%PLA-PEG, 5%PLA-PEG/5%HA-g-PLLA, 5%PLA-PEG/10%HA-g-PLLA, 5%PLA-PEG/15%HA-g-PLLA were prepared using electrospinning technique and divided into four experimental groups. Mouse osteoblasts were inoculated on the materials. A statistical analysis was done based on results from cell dyeing and alkaline phosphatase detection at certain time points to evaluate the effect of new materials on osteoblast adhesion, proliferation and viability.
RESULTS AND CONCLUSION: In the experiment of cell multiplication and the test of alkaline phosphatase activity, both absorbance values and activity of alkaline phosphatase from high to low were 5%PLA-PEG/10%HA-g-PLLA > 5%PLA-PEG/15%HA-g-PLLA > 5%PLA-PEG/5%HA-g-PLLA > 5%HA-g-PLLA (P < 0.05). The absorbance value of PLA-PEG/HA-g-PLLA roughly presented a waveform with the increasing addition of HA-g-PLLA. The effect of PLA-PEG/HA-g-PLLA composite fibrous material on adhesion, multiplication and osteogensis of osteoblasts increases with addition of HA-g-PLLA in a certain range.

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Key words: tissue engineering, osteoblasts, proliferation, alkaline phosphatase

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

在骨组织工程不断发展的历程中，多种无机、有机和高分子材料被研发和利用。先后涌现出羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和聚乳酸(polylactic acid，PLA)等一大批具有代表的支架材料^[1-3]。羟基磷灰石类似于人骨组织中的磷灰石成分，它易溶于酸，具有的生物相容性、骨传导性，成骨性强，但其可吸收性差，力学性能脆的弱点限制了其开发和利用^[4]。同样，聚乳酸具有良好的可降解性和生物相容性，但其疏水性强，降解产物为酸性，易引起无菌性炎症反应，且成骨性能不理想，这些缺陷意味着这种材料表面不利于细胞的黏附生长^[5]。由此可见，由于其自身不足的存在，单独使用一种材料制备支架材料，难以达到很好的效果。针对上述问题，各界学者经过不断探索认识到：现存的具有不同的属性的多种材料，可以通过化学或者物理的方法进行有效的整合，从而摒弃材料的缺陷并将其优势加以利用。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)有着良好的亲水性和生物相容性，利于材料表面的细胞黏附^[6]。于是，有研究将聚乙二醇与聚乳酸制成共聚物，其中的聚乙二醇有亲水基团，从而改变了单一聚乳酸的疏水性。通过调节聚乳酸和聚乙二醇的比例可以控制共聚物的降解速度，经过实验验证其亲水性和细胞相容性得到较大改善^[7-8]。但这种共聚物仍然不算完美。其在体内降解产物为酸性易引发周围组织蛋白变性具有抗原性，且可以激活机体补体系统从而产生无菌性炎症反应^[9]。同样，左旋聚乳酸(poly-L-lactide，PLLA)是聚乳酸同分异构体的一种单体，可提供较好的力学性能及生物降解性^[10]。将羟基磷灰石与左旋聚乳酸接枝，可以制造一种良好的生物降解骨组织替代材料。羟基磷灰石的存在减缓了左旋聚乳酸的降解和吸收的速度，改善了左旋聚乳酸降解的酸性环境而避免了无菌性炎症的发生，且增加了材料的机械强度，同时提供了Ca²⁺，促进新骨的形成^[11-12]。其他的研究也证实了将几种单一材料相互复合可以使其性能相互优化，取得较为满意的效果^[13-15]。这种经过改性的复合材料已经对骨缺损的修复展现出乐观的前景^[16-17]，目前已成为研究的热点领域之一。

由于聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)材料就有良好的组织相容性及生物降解性，同时表面接枝羟基磷灰石(HA-g-PLLA)材料又具有相当的机械强度及促进骨形成的能力，另外两者同时存在避免了无菌性炎症的发生。故可以推测将上述两种材料进行复合制成一种新的材料，能更好的发挥其作为成骨材料的作用。

实验采用两种材料共混合溶液制备的纳米纤维复合材料，通过实验证实其具有更好的成骨活性，而且确定了该材料对成骨细胞性能最好时两种基础材料的配比关系，为其将来的进一步实验奠定基础并提供依据。

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材料方法

设计：材料学体外实验。

时间及地点：于2013年9月至2014年3月在桂林医学院科学实验中心完成。

材料：实验中所用的纤维材料均由中国科学院长春应用化学研究所提供。根据文献[18-21]提供的相关材料制备方法及评价方法，技术人员制备了聚乳酸-聚乙二醇共聚物/表面接枝羟基磷灰石复合纤维材料。通过调整静电纺丝溶液中PLA-PEG和HA-g-PLLA的质量百分数比例，分别制备了质量百分数为5%PLA-PEG/0%HA-g-PLLA、5%PLA-PEG/5% HA-g-PLLA，5%PLA-PEG/10%HA-g-PLLA和5%PLA-PEG/ 15%HA-g-PLLA的4种新型成骨纤维材料样品。

细胞：实验所用细胞为第9代小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)，购买自中国科学院基础医学研究所协和细胞库。

实验方法：

分组及干预：将制备的4个样品分为4组，每组设4个平行样，设为样品1，2，3，4，PLA-PEG/HA-g-PLLA在溶液中的质量百分数比分别为5%/0%，5%/5%，5%/10%和5%/15%。使之与成骨细胞共培养。利用上述材料成分上的差异来干预成骨细胞的黏附、增殖及其活性。

成骨细胞的培养与传代：将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁生长铺满瓶壁80%时即可采用胰蛋白酶消化法进行传代。

材料与成骨细胞体外共培养：将实验材料裁剪成24孔板培养孔直径大小圆形并固定于孔内，然后每孔加入 0.5 mL完全培养液预湿1 h，弃去培养液，用缓冲液冲洗3遍。培养板每孔加入成骨细胞，细胞黏附实验及增殖采用细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，碱性磷酸酶测定实验采用细胞浓度为5×10⁹ L^-¹，每孔加100 μL细胞悬液，含5×10⁵细胞。然后放于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中。培养4 h后成骨细胞较好地贴壁生长，取出24孔板，每孔里加完全培养液1 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱，隔日换液。各组材料分别培养4，7 d后进行相关试验。

成骨细胞黏附性试验：在细胞复合培养至第4，7天，取出细胞与材料接种的培养板并吸弃培养孔中培养液。用PBS冲洗，然后用40 g/L多聚甲醛固定，每孔加入新鲜配制DAPI染液进行染色，并固定于载玻片，共聚焦激光荧光倒置显微镜下，用数码摄像系统观察并拍照。

MTT检测成骨细胞增殖情况：分别在材料接种培养至第4，7天时，取出细胞与材料接种的细胞培养板，采用MTT检测方法，全自动酶标仪设定在紫外线540 nm单波长处测定各孔吸光度值。

成骨细胞碱性磷酸酶活性测定：当细胞在材料上培养至第7天，吸弃培养液，缓冲液洗3遍后加入体积分数1% TritonX-100细胞裂解液100 μL冰上裂解5 min，再按照碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书测定共培养成骨细胞碱性磷酸酶活性。

主要观察指标：各组细胞在培养4，7 d后黏附性的DAPI染色结果、增殖情况和碱性磷酸酶活性值。

统计学分析：计量数据用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，多组间数据比较采用单因素方差分析和SNK检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

本次实验的细胞在材料上的增殖、生长和分化性能，以及测定细胞的一些重要功能分子的表达是验证支架材料优良性的具体评价方法^[22]。它不但可以为体内植入实验的继续观察研究提供大量有用的数据，也是判定其是否能够进入临床应用的必要前提。体外实验可控性强，操作相对简单，并且能够研究材料某种单一因素对机体的影响，在观察将细胞或组织与材料接种培养后所发生的影响变化方面有较大的优势^[23]。细胞与材料共同复合培养时增殖活性的强弱可以更直接地显示出细胞在材料上的生长情况，证明材料是否影响细胞的生长和增殖，从而评价材料与成骨细胞相容性的程度。在当今对支架材料的研究中，材料对细胞增殖和生长的影响已作为评定材料优良性的重要参考指标。因此，实验设计合理，选用方法得当。实验结果可以作为材料评价的有效指标。 PLA-PEG/HA-g-PLLA复合材料具有良好的生物相容性，提高了成骨细胞的增殖及细胞活性。如试验结果显示，样品1组在3个实验中的指标均低于其他各组。可见HA-g-PLLA的引入，显著提高了PLA-PEG材料对成骨细胞的黏附、增殖及提高细胞活性的作用。虽然PLA-PEG作为一种高分子共聚物，它的降解产物可以进入三羧酸循环或者经肾脏代谢掉，无毒不良反应^[24]，可以作为骨组织工程材料已经被证实^[25]。但早期研究显示，羟基磷灰石与左旋聚乳酸结合物制备的工程材料可能促进了骨细胞的生长^[26]。羟基磷灰石与左旋聚乳酸混合物被通过静电纺丝制成纤维膜，不但模仿了天然骨基质的结构，同时也强化了它作为骨组织替代材料的作用^[27-28]。Zong等^[29]的实验结论也认为两种材料混合利用，有较好细胞的黏附，利于骨细胞生长及骨缺损修复。这与羟基磷灰石通过在胶原蛋白纳米级的间隙内的聚集作用可以加强骨的矿化及骨细胞的成长有关。

HA-g-PLLA是羟基磷灰石经过表面接枝修饰后的产物，与单纯的羟基磷灰石相比，它的分子更容易在静电纺丝溶液中均匀分散并保持稳定性。这有利于制备形貌一致的纤维，从而提高纤维作为组织工程材料的能力^[30]。这种接枝材料也被证实对骨的矿化作用及成骨细胞生长有明显的作用^[31]。实验将这两种具有优势的材料通过符合方法制备成新型复合材料，提高了材料的性能，更有利的发挥其作为组织工程材料的作用。两种原材料的质量百分数比例差异影响了成骨细胞的黏附、增殖及活化。质量百分数为5%的PLA-PEG的确定满足静电纺丝技术队溶液浓度的需要，合适的浓度有利于控制纤维的形貌特征，这对骨细胞的黏附增殖及发挥成骨作用是有帮助的。从3个实验的结果可以看出，10%的表面接枝羟基磷灰石材料较5%及15%两组材料，为成骨细胞提供了更好的黏附、增殖及活化条件。而且，3组不同含量的材料对细胞有显著的差异。可见，新型材料中表面接枝羟基磷灰石含量影响了材料的生物学性能。过高或过低的含量均不利于其性能发挥。由于新型材料中的降解或代谢产物可以影响成骨细胞生长的微环境，故合适的成分比例可对细胞活性产生深远的影响。这种影响主要与下列几个因素因素有关：①接枝的羟基磷灰石粒子从复合物中脱离出来暴露于培养液中，它们导致了微环境的改变，从而影响了成骨细胞的活性。如介质的碱性化等，对细胞代谢有积极的影响作用^[32]。②从复合材料上降解形成的聚乳酸等酸性产物能引起环境中pH值下降，从而影响材料表面的细胞行为，影响成骨细胞在材料表面的黏附和增殖。材料中过高的p-羟基磷灰石含量将产生较多的乳酸，对细胞行为影响相对较大。样品4中聚乳酸含量高，对成骨细胞的生物学行为起到抑制作用，细胞增殖能力低于样品3组材料。③材料降解释放的钙离子可刺激成骨细胞分泌一些生物活性蛋白，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和其他黏附糖蛋白，这些生物活性蛋白可以反过来调节细胞和材料界面间的反应^[33]。培养液中适量的钙离子可能对发挥生物活性蛋白对于骨形成细胞的黏附和活性起到了重要的作用。④工程材料的表的化学性质及所含的羟基磷灰石密度影响细胞最初阶段的黏附效果^[34]。这与实验得到的结果一致，因为羟基磷灰石密度是由其含量决定的，故可以间接解释实验中的结果产生的原因^[35-44]。⑤这种现象还可能和无机粒子释放离子、聚乳酸降解以及细胞和复合材料间其他的相互作用等诸多因素有关^[45]。本课题通过几种方法证实，在聚乳酸材料中加入表面接枝的羟基磷灰石后的符合材料可以提高其作为骨组织工程材料的能力。虽然在细胞黏附实验中，没有对各组数据进行细致描述并进行统计分析，但各组细胞染色结果可以明显看出细胞数量的不同，故可以证实黏附效果的差异。实验虽然证实了表面接枝羟基磷灰石含量影响了材料的生物学性能，但4组样品间明显的统计学差异在实验前没有预计到。产生这种结果的真正原因及是否能够进一步控制羟基磷灰石含量，从而实现材料性能最大限度优化还有待于进一步研究。

综上所述，在PLA-PEG纤维材料中引入HA-g-PLLA，能提高材料的细胞相容性，加强细胞的成骨活性，是一种良好的修复骨缺损替代材料。在材料中HA-g-PLLA的含量对材料作为骨组织工程材料的性能有较大的影响。实验中，质量百分比为5%PLA-PEG/10%HA-g-PLLA的纤维材料显示了最佳的细胞相容性及活化细胞的能力。

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